Оптимизированный агонист Nurr1 обеспечивает заболевание

Nature Communications, том 14, номер статьи: 4283 (2023) Цитировать эту статью

3438 Доступов

46 Альтметрика

Подробности о метриках

Ядерный рецептор Nurr1 имеет решающее значение как для развития, так и для поддержания дофаминовых нейронов среднего мозга, представляя собой многообещающую молекулярную мишень для болезни Паркинсона (БП). Ранее мы идентифицировали три агониста Nurr1 (амодиахин, хлорохин и глафенин), которые имеют одинаковый химический каркас, 4-амино-7-хлорхинолин (4A7C), что указывает на взаимосвязь между структурой и активностью. Здесь мы сообщаем о систематическом поиске в области медицинской химии, в ходе которого было получено и охарактеризовано более 570 производных 4A7C. Множество соединений усиливают транскрипционную активность Nurr1, что приводит к идентификации оптимизированного проникающего в мозг агониста 4A7C-301, который проявляет сильные нейропротекторные эффекты in vitro. Кроме того, 4A7C-301 защищает дофаминовые нейроны среднего мозга в модели БП у самцов мышей, индуцированной MPTP, и улучшает как моторные, так и немоторные обонятельные нарушения без дискинезиоподобного поведения. Кроме того, 4A7C-301 значительно облегчает невропатологические нарушения и улучшает моторные и обонятельные дисфункции в моделях мужских мышей, опосредованных AAV2, со сверхэкспрессией альфа-синуклеина. Эти свойства 4A7C-301, модифицирующие заболевание, могут служить основанием для клинической оценки этого или аналогичных соединений для лечения пациентов с БП.

Болезнь Паркинсона (БП), поражающая 2–3% населения старше 65 лет, является вторым по распространенности нейродегенеративным заболеванием после болезни Альцгеймера1,2,3. Избирательная дегенерация дофаминовых нейронов среднего мозга (mDAN) в черной субстанции, а также накопление и агрегация нейротоксического α-синуклеина (αSyn) в тельцах Леви являются отличительными патологическими особенностями БП. Считается, что манифестация БП вызвана совместным действием генетических факторов и факторов окружающей среды через множество взаимодействующих путей, включая митохондриальную дисфункцию, окислительный стресс, нейровоспаление и нарушение регуляции деградации белков/аутофагии3,4,5,6,7. В настоящее время золотым стандартом лечения является заместительная дофаминовая (ДА) терапия (например, L-ДОФА). Хотя это значительно улучшает качество жизни пациентов с БП, терапевтическое окно без неприемлемых побочных эффектов, таких как дискинезия, и степень пользы со временем уменьшаются8,9, и не существует лечения, которое могло бы остановить или замедлить прогрессирование заболевания. Таким образом, существует большая неудовлетворенная потребность в разработке нового модифицирующего заболевание лечения PD10,11.

В течение последних нескольких десятилетий транскрипционные регуляторные каскады mDAN были всесторонне изучены12. Два основных пути развития mDAN (т.е. Sonic hedgehog-FoxA2 и Wnt1-Lmx1A) сходятся, чтобы индуцировать Nurr113,14,15, подчеркивая, что Nurr1 является главным регулятором mDAN. Действительно, исследования с нокаутом Nurr1 (KO) и условным нокаутом на мышах показали, что Nurr1 необходим не только для развития16, но также и для поддержания взрослых mDANs17. Кроме того, было показано, что Nurr1 защищает mDAN от гибели, вызванной нейровоспалением, путем подавления экспрессии нейротоксических провоспалительных генов4. Более того, сообщалось, что экспрессия Nurr1 значительно снижается в мозге как пожилых, так и спорадических пациентов с БП18,19,20.

Nurr1 принадлежит к подсемейству ядерных рецепторов NR4A, что позволяет предположить, что его транскрипционная функция может модулироваться синтетическими и/или эндогенными лигандами21. Кроме того, Nurr1 может функционировать как активатор транскрипции и как репрессор, в зависимости от клеточного контекста (например, в mDANs16 и микроглии4 соответственно). Чтобы начать решать вопрос о том, может ли Nurr1 быть молекулярной мишенью для модифицирующего заболевание лечения PD22, мы создали высокопроизводительные системы анализа и предварительно проверили библиотеку препаратов, одобренных FDA США. Мы идентифицировали три препарата, а именно амодиахин (AQ), хлорохин (CQ) и глафенин, которые значительно усиливают транскрипционную активность Nurr1 за счет прямого связывания с его лиганд-связывающим доменом (LBD)23. Все три препарата имели одинаковую химическую основу, а именно. 4-амино-7-хлорхинолин (4A7C), что побудило нас предположить, что этот мотив 4A7C представляет собой взаимосвязь структура-активность (SAR), которую можно использовать для идентификации лучших производных 4A7C с более высокой эффективностью и меньшими побочными эффектами с помощью лекарственных средств на основе SAR. химия24. В соответствии с этой гипотезой недавние работы Munoz-Tello et al. 25 и Виллемс и др. 26,27 показали, что AQ и CQ и их производные могут действовать как агонисты Nurr1. Виллемс и др. 26 также сообщили, что удаление 7-хлор- или 4-аминогруппы фармакофора 4A7C приводит к потере активности, что еще раз подтверждает нашу гипотезу о том, что 4A7C является действительным фармакофором для разработки мощных агонистов Nurr1. С этой целью мы провели систематические исследования в области медицинской химии, используя CQ в качестве исходного соединения, поскольку он относительно безопасен и до сих пор широко используется для лечения заболеваний человека, таких как малярия и аутоиммунные заболевания28. Мы охарактеризовали множество (>570) производных 4A7C с помощью биохимических, молекулярных и клеточных анализов и определили окончательного кандидата, 4A7C-301, который демонстрирует значительно более высокую эффективность и обеспечивает нейропротекторное действие, основанное на механизме, как на моделях БП in vitro, так и in vivo. , отдельно используя как экологические (ингибитор митохондриального комплекса I 1-метил-4-фенилпиридиний (MPP+)) так и генетические (αSyn) модели факторов риска БП. В отличие от L-DOPA или CQ, 4A7C-301 значительно улучшил как моторные, так и немоторные дисфункции без побочных эффектов, таких как дискинезия или ингибирование аутофагии. Наши данные демонстрируют принципиальный подход к тому, что оптимизированные агонисты Nurr1 могут обеспечить модифицирующее заболевание лечение как спорадической, так и семейной БП.

morpholine > piperidine, the derivative 4A7C-301 with highest fold-induction (18.12 fold) and significantly lower EC50 value (6.53 µM) than CQ (50.25 µM) was selected as a preclinical candidate for further studies (Fig. 1c; Supplementary Table 1). Brain permeability of 4A7C-301 was assessed by analysis of blood plasma and brain homogenates at different time points after oral administration in SD rats (20 mg/kg). 4A7C-301 penetrated into the brain well and was consistently maintained in the brain (Supplementary Fig. 1a–c)./p>60%) together with activation of ionized calcium-binding adaptor molecule 1 (Iba-1)-positive microglia. Pre-treatment with CQ or 4A7C-301 significantly rescued mDANs in a dose-dependent manner. 4A7C-301 showed maximal effect at 500 nM, which is a 40 times lower concentration than required for a similar CQ effect (20 µM) (Fig. 2d, e). In addition, 4A7C-301 optimally suppressed microglial activation against LPS at 500 nM, which is 40 times lower than CQ (Fig. 2f, g). To address whether CQ and 4A7C-301 can suppress the expression of pro-inflammatory genes in microglia (in the absence of mDANs), we used LPS to induce inflammation in mouse microglia-derived BV2 cells, leading to a dramatic induction of the tumor-necrosis factor-α (TNFα) gene, which was robustly suppressed by CQ and 4A7C-301 (Supplementary Fig. 6). In this assay, 4A7C-301 exhibited a much higher potency than CQ, with EC50 of ~1 and ~100 nM, respectively. Collectively, our data show that 4A7C-301 protects mDANs from MPP+- and LPS-induced cell death while suppressing neuroinflammation with a much higher potency than CQ for both effects./p> 0.05), one-way ANOVA. Data are mean ± s.e.m. n = 8 per group. g, h Immunohistochemical analyses of TH+ neurons by densitometry in the STR. Scale bar, 500 µm. One-way ANOVA, Tukey’s post-hoc test; n = 5 per group. Data are mean ± s.e.m. i–k Immunohistochemical analyses of TH+ DA neurons (I, j) and NeuN+ neuros (I, k) in the SNpc. Scale bars, 500 µm.One-way ANOVA, Tukey’s post-hoc test; j, n = 5 per group; k, n = 4 per group. Data are mean ± s.e.m. l Representative pS129 immunohistochemistry in the SNpc. Scale bars, 250 µm. m, Quantification of pS129 αSyn+ cells by counting. One-way ANOVA, Tukey’s post-hoc test; n = 5 per group. Data are mean ± s.e.m. n Western blot analyses of human-αSyn in the SNpc of AAV-αSyn-injected mice. Values are expressed as a relative expression compared to contralateral side. One-way ANOVA, Tukey’s post-hoc test; n = 3 per group. Data are mean ± s.e.m. o–q Immunohistochemical analyses of Iba-1+ microglia by counting in the STR (p) and SNpc (q). One-way ANOVA, Tukey’s post-hoc test; n = 5 per group. Data are mean ± s.e.m. Scale bars, 250 µm./p>570 derivatives of CQ and characterized them, resulting in the identification of an optimized agonist, 4A7C-301. Here, we tested 4A7C-301 and CQ for their effects on various in vitro and in vivo models of PD and propose that 4A7C-301 may provide a disease-modifying treatment for PD, as evidenced by the following results./p>20-fold), suggesting a mechanism-based Nurr1 activation. Our data revealed that 4A7C-301 effectively enhances both Nurr1’s transcriptional activator function (e.g., expression of mDAN-specific genes and production of DA in mDANs) and its repressor function (e.g., suppression of pro-inflammatory cytokine genes and microglial activation) with equally greater efficiency than CQ (>20-fold). Second, we observed that treatment with CQ or 4A7C-301 significantly restored Nurr1 protein levels that were reduced by MPP+ treatment and αSyn overexpression without change in their mRNA levels, strongly suggesting that Nurr1 ligands can regulate the levels of Nurr1 protein at the post-transcriptional levels. Thus, we speculate that Nurr1 ligands may regulate Nurr1 protein’s stability, which is vulnerable and down-regulated by environmental (MPP+) and/or genetic (αSyn) toxicity and that 4A7C-301 (and CQ to a lesser degree) exhibits neuroprotective effects by two distinct mechanisms: (1) activating Nurr1’s transcriptional function and (2) stabilizing and restoring Nurr1 protein levels. Third, using diverse cellular models, we found that 4A7C-301 substantially protects mDA cells via multiple downstream pathways such as reduction of oxidative stress and cytotoxicity, protection of mitochondrial function, induction of mDAN-specific gene expression, including GDNF-receptor c-ret, and reduction of neuroinflammation. Furthermore, while CQ inhibits autophagy, 4A7C-301 does not. In fact, 4A7C-301 restores cellular autophagy functions impaired by MPP+ treatment. Since CQ is a prototype autophagy inhibitor and known to accelerate the deposition of αSyn pathology55, CQ’s autophagy inhibition and 4A7C-301’s autophagy protection is an important distinction. We speculate that the same core structure allows CQ and 4A7C-301 to bind Nurr1 (related to the putative SAR) and show similar activities in most assays, while their different side chain structures most likely underlie their distinct effects on autophagy. In support of this, CQ and BafA1, both well-known autophagy inhibitors, significantly increased lysosomal pH, while 4A7C-301 had no effect, suggesting possible mechanisms underlying CQ/4A7C-301’s different effects on autophagy. Fourth, in MPTP- and αSyn-induced mouse models, 4A7C-301 significantly restored motor deficits and non-motor behavior (e.g., olfactory defects) without any dyskinesia-like side effects. A major limitation of current pharmacological treatments of PD is that they eventually induce side effects such as dyskinesia in many patients8,9. As expected, L-DOPA administration induced robust dyskinesia-like behavior in MPTP-induced mice. In sharp contrast, despite comparable improvements in motor tests, treatment with 4A7C-301 or CQ did not induce any detectable dyskinesia-like behavior. A possible action mechanism of 4A7C-301/CQ in the MPTP model is that they may influence metabolism of MPTP to MPP+. However, this explanation is unlikely because 4A7C-301/CQ were administered 6 h post MPTP injection, the time point when MPTP is completely metabolized into MPP+ in both the striatum and SN56./p>

50% of the observation time; 3 = display dyskinesia for the entire observation period but ceased upon external stimuli; 4 = display continuous and unceasing dyskinesia). To get a better and more sensitive validation of mice dyskinesia, we included an amplitude AIMs score, which rates the degree of deviation of body part or muscle position from its resting position on a 0-4 scale as previously described8. Finally, global AIMs score was calculated by multiplying basic AIMs and amplitude AIMs scores for each subtype on each session. Data points were plotted as the grand total of individual AIMs score on each testing day./p>